Samanburður á mismunandi Super-Resolution smásjártækni
Fyrir hefðbundna ljóssmásjárskoðun takmarkar ljósdreifing myndupplausn við um það bil 250 nm. Í dag geta ofurupplausnartækni bætt þetta um meira en stuðul upp á 10. Þessi tækni er aðallega náð með þremur aðferðum: staðsetningarsmásjárgreiningu á einni sameind, þar á meðal ljósnæm staðsetningarsmásjá (PALM) og stochastic optical reconstruction smásjá (STORM); skipulagð lýsingarsmásjá (SIM); og örvuð útblásturssmásjá (STED). Hvernig á að velja ofurupplausnartækni er það sem öllum er sama um. „Því miður eru engar einfaldar reglur til að ákveða hvaða aðferð á að nota,“ segir Mathew Stracy, nýdoktor við Oxford-háskóla í Bretlandi. "Hver og einn hefur sína kosti og galla." Vísindamenn eru auðvitað líka að finna út hvernig á að velja réttu aðferðina fyrir tiltekið verkefni. "Í samhengi lífmyndagerðar eru lykilþættir sem þarf að huga að eru: staðbundin og tímabundin upplausn, næmi fyrir ljósskemmdum, merkingargetu, sýnisþykkt og bakgrunnsflúrljómun eða samgenga flúrljómun frumna." Hvernig það virkar Hinar ýmsu ofurupplausnar smásjár virka á mismunandi hátt. Þegar um PALM og STORM er að ræða er aðeins lítið brot af flúrljómandi merkjum örvað eða ljósvirkjað á tilteknu augnabliki, sem gerir sjálfstæða staðsetningu þeirra kleift með mikilli nákvæmni. Að fara í gegnum þetta ferli með öllum flúrljómandi merkingum leiðir til algjörrar ofurupplausnar myndar. Stefan Hell, einn af sigurvegurum Nóbelsverðlaunanna í efnafræði 2014 og forstöðumaður Max Planck Institute of Biophysical Chemistry, sagði: „PALM/STORM kerfið er tiltölulega auðvelt að setja upp, en það er erfitt að nota það, vegna þess að flúrljómandi hópurinn verður að hafa ljósvirkjunarhæfileika. Takmarkanir Ókosturinn er sá að þeir þurfa að greina eina flúrljómandi sameind í samhengi frumu og eru óáreiðanlegri en STED." STED notar leysipúls til að örva flúorfórinn og hringlaga leysir til að slökkva á flúorfórnum og skilur aðeins eftir milli nanómetra-stærð flúrljómun fyrir ofurupplausn. Að skanna allt sýnishornið framleiðir mynd. „Kosturinn við STED er að þetta er hnappatækni,“ útskýrði Hell. „Það virkar eins og venjuleg flúrljómunarsmásjá. Það getur einnig myndað lifandi frumur með því að nota flúorófór eins og græn eða gul flúrljómandi prótein og litarefni sem eru unnin af rhodamíni. Samanburður með færibreytum Þrátt fyrir að allar ofurupplausnaraðferðir fari fram úr hefðbundinni ljóssmásjárskoðun hvað upplausn varðar, eru þær ólíkar hver annarri. SIM tvöfaldar um það bil upplausnina í um 100 nm. PALM og STORM geta leyst 15 nm skotmörk. Samkvæmt Hell gefur STED staðbundna upplausn upp á 30 nm í lifandi frumum og 15 nm í föstum frumum. Þegar kemur að sérstökum forritum verðum við einnig að huga að merki-til-suðhlutfalli. Í sumum tilfellum getur minni upplausn en hærra SNR leitt til betri myndar en hið gagnstæða (hærri upplausn en lægra SNR). Hraði myndtöku er einnig mjög mikilvægur, sérstaklega fyrir lifandi frumur. „Allar ofurupplausnaraðferðir eru hægari en hefðbundnar flúrljómunartækni,“ sagði Stracy. "PALM/STORM er hægastur, það þarf tugþúsundir ramma til að ná einni mynd, SIM þarf tugi ramma og STED er skönnunartækni, þannig að tökuhraði fer eftir stærð sjónsviðsins." Til viðbótar við lifandi frumur eða fastar myndgreiningarfrumur vilja sumir vísindamenn líka skilja hvernig hlutir hreyfast. Stracy hefur áhuga á að skilja gangverk líffræðilegra kerfa í lifandi frumum, ekki bara kyrrstæðum myndum. Hann sameinar PALM við rakningu stakra agna til að greina gangverki í lifandi frumum. Þannig getur hann beint fylgst með merkjasameindunum þegar þær sinna hlutverki sínu. Hins vegar telur hann að SIM henti ekki til að rannsaka þessi kviku ferla á sameindastigi, en vegna þess að það er fljótur að safna hraða hentar það sérstaklega vel til að fylgjast með gangverki stærri mannvirkja eins og heilra litninga. Nýjustu niðurstöður Árið 2017 greindi lið Hell's frá MINFLUX ofurupplausnarsmásjánni í Science. Samkvæmt Hell nær þessi ofurupplausnaraðferð í fyrsta sinn staðbundinni upplausn upp á 1 nm. Að auki getur það fylgst með einstökum sameindum í lifandi frumum að minnsta kosti 100 sinnum hraðar en aðrar aðferðir. Aðrir vísindamenn töluðu einnig mjög um MINFLUX smásjána. „Ný forrit og aðferðir eru stöðugt í þróun, en tvær framfarir standa upp úr fyrir mig,“ sagði Shechtman. Eitt er MINFLUX. "Það notar sniðuga aðferð til að fá mjög nákvæma sameindastaðsetningu." Varðandi seinni spennandi þróunina nefndi Shechtman WE Moerner og samstarfsmenn hans við Stanford háskólann. Moerner hlaut einnig Nóbelsverðlaunin í efnafræði árið 2014. Einn af sigurvegurunum. Til að takast á við takmörkun myndgreiningarupplausnar sem stafar af anisotropic dreifingu flúrljómandi stakra sameinda, notuðu vísindamennirnir mismunandi örvunarskautun til að ákvarða stefnu og staðsetningu sameindanna. Að auki hafa þeir þróað viðkvæma pupil yfirborð. Þessar aðferðir bæta getu til að staðsetja mannvirki. Um flúrljómandi merki Í mörgum forritum með ofurupplausn skipta merki mjög miklu máli. Það eru líka nokkur fyrirtæki sem veita tengdar vörur. Til dæmis hefur þýska Miltenyi tekið höndum saman við Abberior, fyrirtæki stofnað af Stefan Hell, til að veita sérsniðna mótefnasamtengingarþjónustu fyrir smásjárlitarefni með ofurupplausn. Fjöldi annarra fyrirtækja býður einnig upp á samsvarandi merki. „Nano-Boosters okkar eru mjög litlir, aðeins 1,5 kDa, og mjög sérstakir,“ segir Christoph Eckert, markaðsfulltrúi hjá ChromoTek. Þessi prótein binda græn og rauð flúrljómandi prótein (GFP og RFP). Þau eru unnin úr alpakkamótefnabrotum, þekkt sem VHH eða nanobodies, með framúrskarandi bindandi eiginleika og stöðug gæði án breytinga frá lotu til lotu. Þessi merki eru hentug fyrir ýmsar ofurupplausnartækni, þar á meðal SIM, PALM, STORM og STED. Ai-Hui Tang, lektor við læknadeild háskólans í Maryland, og félagar notuðu ChromoTek GFP-Booster og STORM til að kanna útbreiðslu upplýsinga í taugakerfinu. Þeir fundu sameinda nanóþyrpingar, kallaðar nanósúlur, í presynaptic og postsynaptic taugafrumum. Vísindamennirnir telja að þessi uppbygging sýni að miðtaugakerfið notar einfaldar meginreglur til að viðhalda og stjórna taugamótunarvirkni. Ýmsar útgáfur af ofurupplausnarmyndagerð og vaxandi fjöldi aðferða færa vísindamenn enn dýpra inn í líffræðilega leyndardóma. Með því að rjúfa dreifingarmörk sýnilegs ljóss geta líffræðingar jafnvel „fylgst náið með“ virkni frumna.
