Aðalathugunaraðferð sjónsmásjár er flúrljómunarathugun
Flúrljómun fyrirbæri
Flúrljómun vísar til þess ferlis þar sem flúrljómandi efni gefur frá sér ljós með lengri bylgjulengd nánast samtímis þegar það er geislað með ljósi af ákveðinni bylgjulengd (Mynd 1). Þegar ljós af ákveðinni bylgjulengd (örvunarbylgjulengd) lendir á sameind (eins og sameind í flúorófór) frásogast ljóseindorkan af rafeindum sameindarinnar. Því næst fara rafeindirnar úr grunnástandi (S0) yfir í hærra orkustig, spennt ástand (S1'). Þetta ferli er kallað örvun①. Rafeindin helst í spenntu ástandi í 10-9–10-8 sekúndur, þar sem rafeindin missir orku ②. Í því ferli að yfirgefa örvunarástandið (S1) og fara aftur í grunnástandið ③, losnar orkan sem eftir er sem frásogast í örvunarferlinu.
Dvalartími flúrljómandi sameindar í spenntu ástandi er líftími flúrljómunar, yfirleitt í nanósekúndum, sem er eðlislægur eiginleiki flúrljómandi sameindarinnar sjálfrar. Tæknin við myndatöku sem notar líftíma flúrljómunar er kölluð Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), sem getur framkvæmt ítarlegri virkni og nákvæmari mælingar auk flúrljómunarstyrksmyndatöku til að fá sameindabyggingu, millisameindavíxlverkun og sameinda örumhverfi. upplýsingar sem erfitt er að fá með hefðbundinni sjónmyndagerð.
Annar mikilvægur eiginleiki flúrljómunar er Stokes breytingin, munurinn á bylgjulengd á milli örvunar- og útblásturstoppa (Mynd 2). Venjulega er bylgjulengd útblástursljóss lengri en bylgjulengd örvunarljóssins. Þetta er vegna þess að eftir að flúrljómandi efnið er örvað og áður en ljóseindinni er sleppt munu rafeindirnar missa hluta orkunnar í gegnum slökunarferlið. Auðveldara er að sjá flúrljómandi efni með stærri Stokes-tilfærslum undir flúrljómunarsmásjá.
Flúrljómunarsmásjár og flúrljómunarsíublokkir
Flúrljómunarsmásjá er sjónsmásjá sem notar flúrljómunareiginleika til að fylgjast með og mynda, og er mikið notuð í frumulíffræði, taugalíffræði, grasafræði, örverufræði, meinafræði, erfðafræði og öðrum sviðum. Flúrljómunarmyndgreining hefur þá kosti að vera mikil næmni og mikil sérhæfni, og hentar mjög vel til að fylgjast með dreifingu sérstakra próteina, frumulíffæra o.s.frv. í vefjum og frumum, rannsóknum á samstaðsetningu og samspili, og til að fylgjast með lífvirkni. ferli eins og breytingar á jónastyrk.
Flestar sameindir í frumum flúrljóma ekki og til að sjá þær verða þær að vera flúrljómandi merktar. Það eru margar aðferðir við flúrljómandi merkingu, sem hægt er að merkja beint (eins og að nota DAPI til að merkja DNA), eða ónæmislitun með því að nota mótefnavakabindandi eiginleika mótefna, eða markpróteinið er hægt að merkja með flúrljómandi próteinum (eins og GFP, grænt flúrljómandi prótein), eða afturkræf binding. tilbúið litarefni (eins og Fura-2) o.s.frv.
Sem stendur er flúrljómunarsmásjáin orðin staðalmyndabúnaður á ýmsum rannsóknarstofum og myndgreiningarpöllum og hún er góður hjálparhella fyrir daglegar tilraunir okkar. Flúrljómunarsmásjáum er aðallega skipt í þrjá flokka: uppréttar flúrljómunarsmásjár (hentar til skurðar), öfugar flúrljómunarsmásjár (hentar fyrir lifandi frumur, að teknu tilliti til skurða), flúrljómandi steríósjársmásjár (hentar fyrir stærri sýni, svo sem plöntur, sebrafiska (fullorðnir/ fósturvísi), medaka, mús/rottulíffæri osfrv.).
Flúrljómunarsíublokkin er kjarnahluti flúrljómunarmyndagerðar í smásjám. Það samanstendur af örvunarsíu, útblásturssíu og tvíþættum geislaskipti. Það er komið fyrir í síuhjólinu, eins og Leica DMi8 búinn 6-stöðusíuhjóli (Mynd 3). ). Mismunandi smásjár hafa mismunandi hjólastöðu og sumar smásjár nota síuglas.
Síublokkin gegnir mikilvægu hlutverki í flúrljómun: örvunarsían velur örvunarljósið til að örva sýnið og hindrar aðrar bylgjulengdir ljóss; ljósið sem fer í gegnum örvunarsíuna fer í gegnum tvíkróískan geisladofara (hlutverk þess er að endurkasta örvunarljósinu og senda flúrljómunina), Eftir endurspeglun er það fókusað af hlutlinsunni, geislað að sýninu, og samsvarandi flúrljómun er spennt til gefa frá sér ljós. Ljósinu sem geislað er frá er safnað af hlutlinsunni, fer í gegnum tvílita geislaskiptarann og nær útblásturssíunni. Eins og sýnt er á mynd 4: örvunarbylgjulengdin er 450-490nm, tvískiptur geislaskiptirinn endurkastar ljósi sem er styttra en 510nm, sendir ljós lengra en 510nm og móttökusvið útgeislunarljóssins er 520-560nm.
Flúrljómunarsíur sem almennt eru notaðar í flúrljómunarsmásjám má skipta í tvær gerðir: langa rás (LP fyrir stutt) og bandpass (BP fyrir stutt). Hringrásin er venjulega ákvörðuð af miðbylgjulengd og breidd bilsins, eins og 480/40, sem þýðir að ljós frá 460-500nm getur farið í gegnum. Langhliðasíur, eins og 515 LP, gefa ljós með bylgjulengdum lengri en 515 nm (mynd 5).
Flúrljómandi efni hafa sína einkennandi örvunar (gleypni) feril og losunarferil, örvunarhámarkið er tilvalin örvunarbylgjulengd (mikil örvunarvirkni, sem getur dregið úr örvunarljósorku, verndað frumur og litarefni), og losunarferillinn er losunarflúrljómunarbylgjulengd. svið. Þess vegna, í tilrauninni, munum við velja bylgjulengdina eins nálægt örvunartoppnum og mögulegt er fyrir örvun og móttökusviðið þarf að innihalda losunartoppinn. Til dæmis er örvunarhámark Alexa Fluor 488 500nm og hægt er að velja örvunarsíuna 480/40 í flúrljómunarsmásjánni.
Upplýsingar um síukubbana er hægt að skoða í smásjármyndahugbúnaðinum. Að skilja litarefni og finna þá síu sem passar best við sýnið þitt er mikilvægt fyrir flúrljómun. Litrófsupplýsingar um flúrljómandi litarefni og flúrljómandi prótein eru almennt tilgreindar í leiðbeiningunum og er einnig hægt að finna þær á netinu.
Auk örvunar- og útblástursbylgjulengda flúrljómunarnema þarf val á síublokkum einnig að huga að því hvort um ósértæka örvun sé að ræða og hvort það sé krosslitur fyrir marglita merkt sýni. Að auki er nauðsynlegt að huga að flúrljósgjafanum sem notaður er. Sem stendur eru algengustu flúrljósgjafarnir kvikasilfurslampar, málmhalíð lampar og LED ljósgjafar sem hafa þróast hratt á undanförnum árum. Litróf flúrljómandi ljósgjafa er samfellt eða ósamfellt og orkan verður mismunandi á mismunandi bylgjulengdarsviðum. LED ljósgjafi er smám saman að verða aðal ljósgjafinn flúrljómunar smásjár vegna tiltölulega þröngs litrófsbands, stöðugri orkuframleiðsla, langt líf, öruggara og umhverfisverndar og margra annarra kosta.
Til viðbótar við innbyggða síublokk smásjáarinnar er einnig ytra hraðhjól (Mynd 7). Umbreytingarhraði síunnar við hlið ytra hraðhjólsins á Leica er 27ms, sem getur gert háhraða fjöllitatilraunir, eins og FRET og Fura2 hlutfall kalsíummyndatöku. (mynd 8) o.fl.
Fjölbreytt flúrljómunarsmásjármyndatækni
Til að mæta mismunandi flúrljómunarþörfum hafa auk flúrljómunar smásjár verið þróaðar ýmsar flúrljómunarsmásjármyndgreiningarlausnir:
Wide-field háskerpu myndgreiningarkerfi, eins og Leica THUNDER Imager, nota nýstárlega Clearing tækni Leica til að fjarlægja á skilvirkan hátt truflunarmerki sem ekki eru fókusplanar meðan á myndatöku stendur og sýna skýrar myndir og kosti háhraða myndatöku;
The confocal leysir skanna smásjá notar pinholes til að koma í veg fyrir truflun á fókusplani, gerir sér grein fyrir sjónskurði og nær háskerpumyndum og þrívíddarmyndum;
Ofurháupplausnar smásjár og nanósmásjár sem brjótast í gegnum sveiflumörkin geta fylgst með fíngerðum smærri en 200 nm;
Fjölljóseindamyndgreiningarkerfi sem notar meginregluna um fjölljóseindaörvun fyrir myndgreiningu á þykkum vef og djúpt in vivo;
Ljósmyndatækni með mikilli tíma- og staðbundinni upplausn, hröðum myndhraða, hárri upplausn, lítilli ljóseiturhrifum, sérstaklega hentugur fyrir rannsóknir á þróun og kraftmikilli athugun in vivo;
Fluorescence lifetime imaging (FLIM), sem er ekki fyrir áhrifum af þáttum eins og styrk flúrljómandi efna, ljósbleikingu, örvunarljósstyrk o.s.frv., getur framkvæmt ítarlegri virkni og nákvæmari mælingar;
Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) og Fluorescence Cross Correlation Spectroscopy (FCCS), mæla sameindafjölda og dreifingarstuðul flúrljómandi sameinda og greina þannig sameindastyrk, sameindastærð, seigju, sameindahreyfingu, sameindabindingu/dreifingu og sameinda sjónfræðilega eiginleika;
Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRF), með mjög hárri z-ás upplausn, er tilvalin til að rannsaka sameindabyggingu og gangverki frumuhimnuyfirborða.
