Laser Confocal Microscopy - Eiginleikar og forrit
Laser scanning confocal microscopy (LSCM) er tegund af smásjá sem er hönnuð á grundvelli samtengdrar fókustækni, það er leysiljósgjafinn, sýnishornið sem á að mæla og skynjarinn eru allir í samtengdum stöðum við hvert annað.
Grundvallaratriði
Í almennri smásjá er myndflöt athugunar einangruð frá aðliggjandi ásplani með því að falla saman brenniplani hlutlinsunnar við skynjarann, en í samfókussmásjá er ljósblettur sem er takmarkaður við diffrun notað til að lýsa upp sýnið og A. pinhole er notað í safnaða ljósleiðinni við samtengda fókus ljósblettsins til að sía flökkuljós til að skapa þessi einangrunaráhrif og bæta þar með upplausn.
Myndagerðareiginleikar
Myndgreining á sjónhlutaskönnun
Annar eiginleiki við leysiskönnun confocal smásjárskoðun er að það er skönnun myndtækni. Hin hefðbundna breiðsviðslýsingatækni lýsir upp allt sýnishornið, þannig að hægt er að taka myndina beint með berum augum eða skynjara, en LSCM notar geisla eða Margir fókusaðir geislar fara í gegnum sýnið til að skanna og mynda. Myndin sem myndast er kölluð sjónhluti. Eftirfarandi sýnir muninn á hefðbundinni breiðsviðslýsingaraðferð og leysiskönnun confocal lýsingaraðferðarinnar.
Þess vegna er raunveruleg vinnuaðferð nútíma confocal smásjá eins og sýnt er á myndinni hér að neðan. Örvunarljósið sem leysirinn gefur frá sér fer í gegnum tvíhliða spegil og er skannað í x-stefnu og y-stefnu sýnisins í gegnum par af galvanómetrum. Örvun (eða endurspeglun) sýnisins er Ljós fer inn í PMT skynjarann í gegnum gatið og er skráð, og skráða skannaða myndin er endurgerð með tölvu til að endurgera raunverulega sýnismyndina.
Búðu til „z-stack“ myndir á mismunandi brennivítum
Aðeins ljósið sem endurspeglast til baka frá samtengda sýnislagið getur farið í gegnum litla gatið í söfnunarljósinu og endurkast óviðkomandi sýnislagsins sem eftir er er lokað af litla gatinu. Þetta getur leitt til umtalsverðrar endurbóta á upplausn. Samanburður hlið við hlið á fjölvíddar flúrljómunarsmásjárskoðun og confocal smásjá á sama þykka sýninu. Þegar röð mynda er tekin á mismunandi brennivítum er hægt að búa til myndir sem almennt eru kallaðar „z-stafla“, sem sýna upplausnina og birtuskilaaukann sem samfókus smásjárskoðun býður upp á og undirliggjandi orsakir þessara hagnaðar. Sjá má að þegar myndin er skoðuð efst í staflanum með myndflötinn fyrir ofan vefinn kemur í ljós mikið magn af dreifðu ljósi í flúrljómunarmyndinni, á meðan confocal smásjámyndin virðist svört. Þessi lækkun á axial PSF leiðir beint til upplausnarmunarins sem sést við sjónsviðmótið í miðju z-stafla.
Upplausn er stórbætt miðað við breiðsviðslýsingu
Í flúrljómunarsmásjárskoðun er ljósstyrknum sem gefin er út frá einum punkti lýst með punktdreifingaraðgerðinni (PSF) og mynstur hans er Airy diskur. Upplausn flúrljómunarkerfisins er hægt að lýsa með radíus Airy disksins, sem hægt er að lýsa með Tölulegu ljósopi hlutlinsunnar og bylgjulengd örvunarljóssins ákvarða
